O que é sulforafano?

Sulforaphane é um fitoquímico, uma substância dentro do grupo isotiocianato de compostos organosulfurados, encontrado em vegetais crucíferos, como brócolis, repolho, couve-flor e couve de Bruxelas. Ele também pode ser encontrado em bok choy, couve, couve, mostarda e agrião. Estudos de pesquisa mostraram que o sulforafano pode ajudar a prevenir vários tipos de câncer ativando a produção de Nrf2, ou fator nuclear relacionado ao eritroide 2, um fator de transcrição que regula os mecanismos antioxidantes protetores que controlam a resposta da célula aos oxidantes. O objetivo do artigo a seguir é descrever a função do sulforafano.

Sumário

O sistema antioxidante KEAP1-Nrf2-ARE é o principal meio pelo qual as células respondem a estresses oxidativos e xenobióticos. O sulforafano (SFN), um isotiocianato eletrofílico derivado de vegetais crucíferos, ativa a via KEAP1-Nrf2-ARE e tornou-se uma molécula de interesse no tratamento de doenças nas quais o estresse oxidativo crônico desempenha um papel etiológico importante. Nós demonstramos aqui que as mitocôndrias de células epiteliais de pigmento da retina (RPE-1) humanas cultivadas tratadas com SFN sofrem hiperfusão que é independente tanto de Nrf2 quanto de seu inibidor citoplasmático KEAP1. Foi relatado que a fusão mitocondrial é citoprotetora ao inibir a formação de poros nas mitocôndrias durante a apoptose e, consistente com isso, mostramos a citoproteção independente de Nrf2 de células tratadas com SFN expostas ao apoptose-indutor, estaurosporina. Mecanisticamente, o SFN atenua o recrutamento e / ou a retenção do fator de fissão solúvel Drp1 às mitocôndrias e aos peroxissomas, mas não afeta a abundância geral do Drp1. Estes dados demonstram que as propriedades benéficas do SFN se estendem além da ativação do sistema KEAP1-Nrf2-ARE e garantem uma interrogação adicional, dado o uso atual deste agente em múltiplos ensaios clínicos.

Palavras-chave: Sulforafano, Nrf2, Drp1, Mitocôndria, Fissão, Fusão, Apoptose

Introdução

Sulforafano é um inibidor independente da fissão mitocondrial Nrf2

Sulforafano (SFN) é um composto de isotiocianato derivado na dieta mais comumente de vegetais crucíferos [56]. É gerado em plantas como uma resposta xenobiótica à predação via liberação vesicular da enzima hidrolítica mirosinase de células danificadas; esta enzima converte glucosinolatos em isotiociantes [42]. Nas duas últimas décadas, a SFN tem sido amplamente caracterizada por suas propriedades antineoplásicas, antioxidantes e antimicrobianas [57]. Grande parte dessa eficácia tem sido atribuída à capacidade do SFN modular a via de sinalização do elemento de resposta antioxidante KEAP1-Nrf2 (ARE), embora atividades adicionais do composto tenham sido identificadas, incluindo a inibição da atividade da histona deacetilase e da progressão do ciclo celular. 29]. Nrf2 é o principal fator de transcrição antioxidante e, sob condições de homeostase, sua estabilidade é suprimida através da ação do complexo citoplasmático de ubiquitina ligase Cullin3KEAP1 [20]. Especificamente, o Nrf2 recrutado para a ligase Cullin3KEAP1 por ligao ao adaptador de substrato dimico KEAP1 e subsequentemente modificado com cadeias poliUb que visam o factor de transcrio para a degradao mediada por proteassoma. Este volume de negócios constitutivo limita a meia-vida do Nrf2 em células não-tensionadas para ~ 15 min [30], [33], [46], [55]. Em resposta a numerosos tipos de estresse, principalmente o estresse oxidativo, KEAP1, uma proteína rica em cisteína, atua como um sensor redox, e a modificação oxidativa de cisteínas críticas, particularmente C151, de KEAP1 dissocia NRF2-KEAP1 de CUL3, prevenindo a degradação de Nrf2. 8], [20], [55]. Notavelmente, o SFN, e possivelmente outros ativadores Nrf2, mimetizam o estresse oxidativo modificando o C151 de KEAP1, por exemplo, [21]. A estabilização do Nrf2 permite a sua translocação para o núcleo, onde induz a expressão de uma bateria de genes antioxidantes e de desintoxicação da Fase II. O Nrf2 liga-se aos elementos promotores da resposta antioxidante (ARE) dos seus genes alvo cognatos através da heterodimerização com pequenas proteínas Maf [19]. Este sistema apresenta uma resposta dinâmica e sensível a antioxidantes indiretos como o SFN, os radicais livres gerados pelas mitocôndrias [16] ou outras fontes fisiológicas de estresse oxidativo [41].

As mitocôndrias são organelas subcelulares dinâmicas que regulam uma série de funções celulares que vão desde a produção de ATP e tamponamento de cálcio intracelular até a regulação redox e apoptose [13], [49]. As mitocôndrias também representam a principal fonte de espécies reativas de oxigênio (EROs) dentro da célula. A regulação adequada da função mitocondrial é, portanto, necessária para otimizar a produção de ATP para atender às necessidades celulares e, ao mesmo tempo, minimizar os efeitos potencialmente prejudiciais da produção excessiva de radicais livres. Um requisito crítico para a modulação fina da função mitocondrial é a capacidade de as mitocôndrias funcionarem independentemente como máquinas bioquímicas e como parte de uma vasta rede responsiva.

A morfologia e a função da rede mitocondrial são determinadas por um balanço regulado entre a fissão e a fusão. A fissão mitocondrial é necessária para a herança de células filhas de mitocôndrias durante a divisão celular [28], bem como para a degradação seletiva e autofágica de mitocôndrias despolarizadas ou danificadas, denominada mitofagia [1]. Por outro lado, a fusão é necessária para a complementação de genomas mitocondriais e compartilhamento de componentes da cadeia de transporte de elétrons entre as mitocôndrias vizinhas [54]. No nível molecular, a fissão e a fusão mitocondrial são reguladas por grandes GTPases do tipo dinamínico. Três enzimas regulam principalmente a fusão: Mitofusinas 1 e 2 (Mfn1 / 2) são proteínas de membrana externa de duas passagens que medeiam a fusão da membrana externa via interações heterotípicas entre mitocôndrias adjacentes [15], [25], [37], enquanto OPA1 é uma proteína de membrana que garante simultaneamente a conectividade da matriz, regulando a fusão das membranas internas [5]. A atividade GTPase de todas as três proteínas é necessária para a fusão robusta [5], [18] e OPA1 é ainda regulada por proteólise complexa dentro da membrana interna mitocondrial pelas proteases OMA1 [14], PARL [6] e YME1L [45 ]. É importante ressaltar que o potencial de membrana mitocondrial intacta é necessário para a fusão eficiente, a fim de suprimir a integração de mitocôndrias danificadas e saudáveis ​​[26].

A fissão mitocondrial é principalmente catalisada por uma proteína citosólica chamada proteína relacionada à Dynamin 1 (Drp1 / DNM1L). O Drp1 é recrutado do citosol para sítios prospectivos de fissão na membrana externa mitocondrial [43]. Os principais receptores para Drp1 na membrana externa são o fator de fissão mitocondrial (Mff) [32] e, em menor extensão, a Fissão 1 (Fis1) [51]. Adicionalmente, foi descoberto um receptor chamariz, MIEF1 / MiD51, que atua para limitar ainda mais a atividade da proteína Drp1 em potenciais locais de fissão [58]. Uma vez ancorados na membrana externa mitocondrial, o Drp1 se oligomeriza em estruturas em espiral ao redor do corpo da mitocôndria e, em seguida, utiliza a energia derivada da hidrólise do GTP para mediar a cisão física das membranas externa e interna mitocondrial [17]. Túbulos derivados do retículo endoplasmático atuam como um constritor inicial de mitocôndrias antes da oligomerização Drp1, ressaltando a revelação de que as mitocôndrias não constritas são mais largas que a circunferência permissiva de uma espiral Drp1 completa [12]. A dinâmica da actina também é importante para as interações ER-mitocôndrias que precedem a fissão mitocondrial [24]. Além de seu papel na fissão mitocondrial, o Drp1 catalisa a fissão de peroxissomas [40].

O Drp1 é muito semelhante à proteína dinamina bem caracterizada pelo fato de que ambas as proteínas contêm um domínio GTPase N-terminal, um domínio Médio que é crítico para auto-oligomerização e um domínio efetor GTPase C-terminal [31]. Drp1 alcança seletividade para membranas mitocondriais através de uma combinação de interações com suas proteínas receptoras Mff e Fis1 e também através de sua afinidade pela cardiolipina fosfolipídica específica das mitocôndrias via o domínio único de inserção B de Drp1 [2]. Drp1 normalmente existe como um homotetrâmero no citoplasma, e montagem de ordem superior nos locais de fissão mitocondrial é mediada pelo domínio do meio de Drp1 [3].

Dada a ligação implícita entre a função mitocondrial e a via KEAP1-Nrf2-ARE, investigamos os efeitos da ativação de Nrf2 na estrutura e função mitocondrial. Nós demonstramos aqui que o SFN induz a hiperfusão mitocondrial que, inesperadamente, é independente tanto de Nrf2 quanto de KEAP1. Este efeito do SFN é através de uma inibição da função Drp1. Demonstramos ainda que SFN confere resistência à apoptose que é independente de Nrf2 e mimetiza aquela observada em células depletadas de Drp1. Esses dados coletivamente indicam que, além de estabilizar e ativar o Nrf2, o SFN modula a dinâmica mitocondrial e preserva a aptidão e a sobrevivência celular.

Resultados

O sulforafano induz a hiperfusão de mitocôndrias Nrf2 / KEAP1-independente

No decorrer do estudo dos efeitos da ativação de Nrf2 na dinâmica da rede mitocondrial, descobrimos que o tratamento de células epiteliais de pigmento retinal humano imortalizadas (RPE-1) com sulforafano (SFN), um potente ativador de sinalização de Nrf2, induziu uma fusão robusta de a rede mitocondrial quando comparada com células de controle tratadas com veículo (Fig. 1A e B). A morfologia das mitocôndrias nessas células se assemelhava muito à das mitocôndrias em células esgotadas por siRNA de Drp1 endógeno, o principal fator de fissão mitocondrial (Fig. 1A). Este resultado levantou a ideia intrigante de que a fissão mitocondrial e o estado de fusão respondem diretamente aos níveis de Nrf2 na célula. No entanto, a estimulação de células com outros estabilizadores e ativadores de Nrf2, como o inibidor de proteassoma MG132, o pró-oxidante tBHQ, ou o knockdown do inibidor de Nrf2 KEAP1 não induziu a fusão mitocondrial (Fig. 1A e B). A estabilização de Nrf2 por essas manipulações foi confirmada por western blotting para Nrf2 endógeno (Fig. 1C). Além disso, a expressão de Nrf2 era dispensável para a fusão mitocondrial induzida por SFN, uma vez que o knockdown de Nrf2 endógeno com siRNA falhou em contrariar este fenótipo (Fig. 1D F). Porque SFN estimula a via de KEAP1-Nrf2-ARE modificando covalentemente resíduos de cisteína de KEAP1 [21], derrubamos KEAP1 para abordar se a hiperfusão mitocondrial induzida por SFN é estimulada por meio de uma via dependente de KEAP1, mas independente de Nrf2. No entanto, a depleção de KEAP1 também falhou em anular a fusão mitocondrial induzida por SFN (Fig. 1G I). Na verdade, SFN reverteu a morfologia de pró-fissão induzida pela depleção de KEAP1 (Fig. 1G, painel b versus painel d). Estes resultados indicam que o tratamento SFN causa fusão mitocondrial independente da via canônica KEAP1-Nrf2-ARE e nos levou a questionar se SFN afeta diretamente os componentes da fissão mitocondrial ou da máquina de fusão.

Sulforafano prejudica a associação mitocondrial de Drp1

Com base na constatação de que o tratamento com SFN induz a hiperfusão mitocondrial, raciocinamos que esse fenótipo era uma consequência da atividade excessiva de fusão ou uma inibição da atividade da fissão. Para discriminar entre essas duas possibilidades, comparamos a morfologia dos peroxissomas na presença e ausência de SFN. Os peroxissomos são semelhantes às mitocôndrias, pois são organelas dinâmicas cuja forma e comprimento estão constantemente em fluxo [44]. Os peroxissomos contêm tanto Fis1 quanto Mff em sua membrana externa e, como conseqüência, são alvos para a fissão mediada por Drp1 [22], [23]. No entanto, os peroxissomos não utilizam a maquinaria de fusão da rede mitocondrial e, consequentemente, não são submetidos à fusão [39]. Pelo contrário, a fissão peroxisomal é oposta pelo aumento dos peroxissomos existentes através da adição de novo de membranas e proteínas [44]. Como os peroxissomas carecem de Mfn1 / 2 e OPA1, concluímos que se o SFN ativasse a maquinaria de fusão em vez de inibir a maquinaria de fissão, o comprimento do peroxissoma não seria afetado. Nas células tratadas com veículo, os peroxissomos são mantidos como organelas puntiformes curtas e arredondadas (Fig. 2, painéis b e d). Entretanto, o tratamento com SFN aumentou o comprimento do peroxissoma em ~ 2 vezes em comparação com as células controle (Fig. 2, painéis f e h). Além disso, muitos dos peroxissomos estavam comprimidos perto do centro, indicando um potencial defeito de cisão (Fig. 2, painel h, cabeças de setas). Da mesma forma, os peroxissomas em células transfectadas com siRNA Drp1 eram anormalmente longos (Fig. 2, painéis j e l), confirmando que Drp1 é necessário para fissão peroxisomal e sugerindo que o tratamento com SFN causa fenótipos mitocondriais e peroxissômicos ao interromper a maquinaria de fissão.

Em seguida, determinamos como o SFN restringe a função Drp1. As possibilidades incluíram reduções nos níveis de expressão, recrutamento / retenção na mitocôndria, oligomerização ou atividade enzimática da GTPase. Um déficit em qualquer um deles resultaria em redução da fissão mitocondrial e hiperfusão. Não detectamos alterações reproduzíveis nos níveis de proteína Drp1 após o tratamento com SFN (Figs. 1C e 3A) e, portanto, concluímos que SFN não altera a estabilidade ou expressão de Drp1, consistente com Drp1 tendo uma meia-vida de> 10 h [50] e nossos tratamentos SFN sendo de menor duração. Em seguida, investigamos se SFN afetou o recrutamento ou retenção de Drp1 para mitocôndrias. Estudos de fracionamento mostraram que SFN induziu uma perda de Drp1 da fração mitocondrial (Fig. 3A, pistas 7 8 e Fig. 3B). Conforme relatado anteriormente [43], apenas uma pequena fração de Drp1 (~ 3%) está associada à rede mitocondrial em qualquer momento durante as condições de estado estacionário com a maioria da enzima residindo no citoplasma (Fig. 3A, pistas 5 8 ) Estes dados de fracionamento foram confirmados usando análise de co-localização que mostrou uma redução de ~ 40% em focos Drp1 pontilhados localizados na mitocôndria após o tratamento com SFN (Fig. 3C e D). Juntos, esses dados indicam que a fusão mitocondrial induzida por SFN é, pelo menos parcialmente, devido à associação atenuada de Drp1 com as mitocôndrias. Nossos dados não distinguem se SFN interfere com o recrutamento mitocondrial versus a retenção mitocondrial de Drp1, ou ambos, já que a análise de Drp1 endógeno não foi passível de visualizar a GTPase por microscopia de células vivas.

Sulforafano confere proteção contra apoptose induzida por estaurosporina independente de Nrf2

Trabalhos anteriores mostraram que a fissão mitocondrial é permissiva na formação de poros na membrana mitocondrial externa gerados por Bax / Bak durante a apoptose [11]. Drp1 mostrou ser recrutado seletivamente para mitocôndrias durante a apoptose [11] e, consistente com isso, mitocôndrias fragmentadas foram observadas no início do processo [27]. Por outro lado, acredita-se que a inibição da fissão mitocondrial iniba a apoptose ao bloquear a formação dos poros da membrana externa que permitem a liberação do citocromo c [53]. Consequentemente, estimular a fusão mitocondrial atrasa a progressão da apoptose induzida por compostos incluindo estaurosporina (STS) [14]. Para determinar se SFN protege as células RPE-1 da apoptose mediada por STS e, em caso afirmativo, se isso requer Nrf2, estabelecemos um ensaio para induzir prontamente a clivagem da poli ADP ribose polimerase (PARP), um substrato da caspase-3 ativada e marcador definitivo de apoptose. O tratamento de células RPE-1 com 1 M STS por 6 h apenas causou uma clivagem muito modesta de PARP, mas isso foi evitado por co-tratamento com SFN (por exemplo, Fig. 4A, faixa 3 versus 4). Para aumentar a robustez deste ensaio, sensibilizamos ainda mais as células para a apoptose induzida por STS, pré-tratando-as com siRNA visando o fator antiapoptótico, Bcl-XL. Este pré-tratamento reduziu a expressão de Bcl-XL e promoveu marcadamente a clivagem de PARP em função do tempo de exposição ao STS (Fig. 4B, compare a faixa 2 com as faixas 4 10). É importante ressaltar que 2 h de pré-tratamento com SFN mitigou a clivagem de PARP em células expostas a STS (Fig. 4C, faixa 3 contra 4 e faixa 5 contra 6). Da mesma forma, as células com depleção estável de Nrf2 por CRISPR / Cas9 foram comparativamente protegidas da toxicidade de STS por pré-tratamento de SFN (Fig. 4C, pista 11 versus 12 e pista 13 versus 14 e Fig. 4D). Esta proteção foi observada usando a clivagem PARP (Fig. 4C e D) e morfologia celular (Fig. 4E) como leituras. A eficácia da depleção de Nrf2 por CRISPR / Cas9 foi confirmada por western blotting (Fig. 4C, Nrf2 blot). Conforme previsto, a depleção de células de Drp1, que também produz um fenótipo de hiperfusão (Fig. 1A), também bloqueou a clivagem de PARP em resposta a STS em comparação com células de controle incubadas com SFN (Fig. 4F e G). Juntos, esses achados são consistentes com o SFN conferindo proteção contra apoptose por meio de sua capacidade de restringir a função do Drp1, independente da estabilização e ativação do Nrf2.

Discussão

Descobrimos que o SFN modula a dinâmica de fissão / fusão mitocondrial independente de seus efeitos na via KEAP1-Nrf2-ARE. Isso é intrigante por causa de uma suposta ligação entre a disfunção mitocondrial e a produção de ROS e a necessidade de eliminar radicais livres derivados de mitocôndrias através da ativação de Nrf2. Este impacto funcional adicional da SFN é de importância potencial, dados os mais de 30 ensaios clínicos em andamento testando SFN para o tratamento de uma variedade de doenças, incluindo câncer de próstata, doença pulmonar obstrutiva e doença falciforme [7], [10], [ 47].

Como o SFN é um isotiocianato [56] e ativa a sinalização Nrf2 pela acilação direta de cisteínas KEAP1 críticas para suprimir a degradação Nrf2 [21], segue-se que o SFN exerce seus efeitos pró-fusão modulando a atividade de um fator de fissão ou fusão via modificação de cisteína . Nossos dados apoiam fortemente que o Drp1 seja regulado negativamente pelo SFN, embora a GTPase seja um alvo direto de acilação permanece por esclarecer. Apesar dessa lacuna de conhecimento, a função do Drp1 está claramente sendo comprometida pelo SFN, pois tanto as mitocôndrias quanto os peroxissomos se tornam hiperfusíveis em resposta ao tratamento com SFN e essas organelas compartilham Drp1 para seus respectivos eventos de cisão [38]. Além disso, o SFN diminui a quantidade de Drp1 que se localiza e se acumula nas mitocôndrias (Fig. Como nossos experimentos foram feitos com todas as proteínas endógenas, nossa detecção de Drp1 em locais de fissão mitocondrial está sob condições de estado estacionário e, conseqüentemente, não podemos distinguir entre um recrutamento versus um defeito de retenção da enzima causada pelo SFN. Além disso, não podemos eliminar a possibilidade de o SFN acilar um receptor nas mitocôndrias (Fis1 ou Mff) para bloquear o recrutamento de Drp1, no entanto, suspeitamos que o Drp1 seja diretamente modificado. O Drp1 possui nove cisteínas, oito das quais residem no Domínio Médio que é necessário para a oligomerização [3], e uma delas reside no GED (GTPase Effector Domain - GED) no C-terminal de Drp1. A acilação direta de qualquer uma dessas cisteínas poderia causar um defeito de atividade no Drp1 e, portanto, fundamentar o efeito do SFN na dinâmica mitocondrial. Notavelmente, trabalhos anteriores sugerem que defeitos na oligomerização e atividade catalítica podem anular a retenção de Drp1 nas mitocôndrias [52]. Cys644 no domínio GED é um alvo particularmente atraente baseado em trabalhos anteriores mostrando que a mutação dessa fenotopia cisteína mutações que prejudicam a atividade Drp1 GTPase [4] e que esta cisteína particular é modificada por eletrófilos reativos ao tiol [9]. A resolução dessa questão pendente exigirá validação espectrométrica de massa. Em resumo, identificamos uma nova função citoprotetora para o SFN composto clinicamente relevante. Além de ativar o fator de transcrição mestra anti-oxidante Nrf2, o SFN promove a fusão mitocondrial e peroxisomal, e este efeito é independente do Nrf2. O mecanismo subjacente a esse fenômeno envolve uma redução na função do GTPase Drp1, o principal mediador da fissão mitocondrial e peroxisomal. Uma das principais conseqüências da fusão mitocondrial mediada pelo SFN é que as células se tornam resistentes aos efeitos tóxicos da estaurosporina indutora da apoptose. Essa ação citoprotetora adicional da SFN poderia ser de utilidade clínica particular nas numerosas doenças neurodegenerativas para as quais a idade é o principal fator de risco (por exemplo, Doença de Parkinson, Doença de Alzheimer, Degeneração Macular Relacionada à Idade), pois essas doenças têm sido associadas à apoptose níveis e / ou desregulação de Nrf2 [35], [36], [48].

Materiais e Métodos

Ensaios de Apoptose

As células foram semeadas e transfectadas com siRNA como indicado abaixo. As células foram pré-tratadas com sulforafano 50 µM por 2 h para induzir a fusão mitocondrial e foram então tratadas com estaurosporina 1 µM para induzir apoptose. No momento da colheita, o meio foi coletado em tubos individuais e submetido a centrifugação de alta velocidade para sedimentar células apoptóticas. Este sedimento celular foi combinado com células aderentes e solubilizado em tampão Laemmli concentrado 2 vezes. As amostras foram submetidas a western blotting anti-PARP.

Geração de Construções CRISPR / Cas9

Para criar o LentiCRISPR / eCas9 1.1, o LentiCRISPR v2 (addgene #52961) foi primeiro cortado com Age1 e BamH1. Em seguida, SpCas9 de eSpCas9 1.1 (addgene #71814) foi amplificado por PCR com prolongamentos Age1 e BamH1 usando os seguintes primers (Forward AGCGCACCGGTTCTAGAGCGCTGCCACCATGGACTATAAGGACCACGAC, Reverse AAGCGCGGATCCCTTTTTCTTTTTTGCCTGGCCGG) e ligado no vector de corte acima. As sequências de sgRNA foram determinadas usando Benchling.com. Os parâmetros foram definidos para direcionar a sequência de codificação com os maiores pontuações no alvo e mais baixos fora do alvo. As seguintes sequências (sequência de direccionamento sublinhadas, hs sgNFE2L2 # 1 sentido CACCGCGACGGAAAGAGTATGAGC, anti-sentido AAACGCTCATACTCTTTCCGTCGC; hs sgNFE2L2 # 2 sentido CACCGGTTTCTGACTGGATGTGCT, AAACAGCACATCCAGTCAGAAACC anti-sentido; hs sgNFE2L2 # 3 sentido CACCGGAGTAGTTGGCAGATCCAC, anti-sentido AAACGTGGATCTGCCAACTACTCC) foram emparelhados e ligados em BsmB1 cortar LentiCRISPR / eCas9 1.1. Células RPE-1 infectadas por lentivírus foram selecionadas com puromicina e mantidas como uma população agrupada. Knockout foi confirmado por imunofluorescência e western blotting.

Cultura de células e transfecções

As células epiteliais de pigmento da retina humana transformadas com telomerase (RPE-1) (ATCC) foram cultivadas em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 1 g / L de glicose suplementado com penicilina, estreptomicina, 1X coquetel de aminoácidos não essenciais (Life Technologies), e 10% de Soro Fetal Bovino (Life Technologies). Para transfecções de siRNA, 30,000 ~ 35,000 células / mL foram semeadas durante a noite. As células receberam siRNA 10 nM diluído em DMEM sem soro e combinado com 0.3% de reagente de transfecção de interferina (PolyPlus). Para a sensibilização por apoptose, as células receberam 1 nM de siRNA de Bcl-XL. As células foram colhidas 2-3 dias após a transfecção.

Produtos Químicos, Anticorpos e siRNA Oligos

Anticorpos contra? -Tubulina (Cell Signaling),? -Tubulin (Sigma), Drp1 (BD Biosciences), KEAP1 (Proteintech), Lamin B1 (Abcam), PARP (Cell Signaling), PMP70 (Abcam) e Tom20 (BD Biosciences ) foram usados ​​em diluições de 1: 1000 para western blotting e para imunofluorescência. Interno, o anticorpo de coelho anti-Nrf2 foi usado a 1: 2000 para western blotting [34], [59]. Sulforafano (Sigma) e estaurosporina (Tocris) foram usados ​​a 50? M e 1? M, respectivamente. siRNAs contra Drp1 (Dharmacon), Nrf2 (Dharmacon), KEAP1 (Cell Signaling) e Bcl-XL (Cell Signaling) foram usados ​​a 10 nM, salvo indicação em contrário.

Imunofluorescência e Rotulagem in Vivo

As células semeadas em lamínulas de vidro de 18 mm foram tratadas com veículo ou droga, fixadas em formaldeído 3.7% e depois permeabilizadas em Triton X-0.2 / PBS 100% em gelo por 10 min. Os anticorpos primários foram incubados em albumina de soro bovino a 3% (BSA) em PBS durante a noite a 4 C. Após as lavagens com PBS, as células foram incubadas por 1 h em anticorpos secundários conjugados Alexa488- ou Alexa546- apropriados para a espécie (diluídos 1: 1000) e 0.1 µg / mL de DAPI (Sigma) em 3% BSA / PBS. As mitocôndrias foram visualizadas por imunofluorescência anti-Tom20 ou por incubação de células em 200 nM MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes, Inc.) em DMEM sem soro por 30 min a 37 C antes da fixação.

Microscopia e Análise de Imagem

As amostras de imunofluorescência foram visualizadas em um microscópio confocal LSM710 (Carl Zeiss). As micrografias foram capturadas usando objetivas de imersão em óleo 63X ou 100X e as imagens ajustadas e aprimoradas usando Adobe Photoshop CS6. A análise de colocalização foi realizada usando o recurso de colocalização Carl Zeiss LSM710 com limiares definidos manualmente, embora cegos para a identidade das amostras. Barras de escala, a menos que indicado de outra forma, são de 10 XNUMXm. A morfologia mitocondrial foi avaliada por pontuação cega. Se as mitocôndrias de uma célula fossem mantidas como pontos múltiplos, redondos e discriminantes, a célula era classificada como fissão . Se as mitocôndrias individuais fossem indistinguíveis e toda a rede mitocondrial parecesse contínua, a célula era classificada como fusão . Todas as outras células, incluindo aquelas com aglomeração de mitocôndrias, foram pontuadas como intermediárias .

Fraccionamentos Subcelulares

As células RPE-1 foram cultivadas até a confluência. Após uma lavagem com PBS, as células foram submetidas a centrifugação a 600 g por 10 min e ressuspensas em 600 µL de tampão de isolamento (Manitol 210 mM, Sacarose 70 mM, MOPS 5 mM, EDTA 1 mM pH 7.4 + PMSF 1 mM). A suspensão foi lisada 30 vezes em um homogeneizador Dounce. Uma fração do homogenato foi preservada como lisado de células inteiras. O restante foi submetido a centrifugação a 800 g por 10 min para sedimentar núcleos. Os sobrenadantes foram submetidos a centrifugação a 1500 g durante 10 min para limpar os núcleos remanescentes e células não lisadas. Este sobrenadante foi submetido a centrifugação a 15,000 g por 15 min para sedimentar as mitocôndrias. O sobrenadante foi preservado como a "fração citosólica". O sedimento foi lavado suavemente com PBS e ressuspenso em tampão de isolamento. A concentração de proteína de cada fração foi medida por ensaio de ácido bicinconínico (BCA) e quantidades equivalentes de proteína foram resolvidas por SDS-PAGE.

Western blotting

As células foram lavadas em PBS e solubilizadas em tampão de solubilização Laemmli 2 vezes concentrado (Tris 100 mM [pH 6.8], SDS 2%, azul de bromofenol 0.008%, 2-mercaptoetanol 2%, glicerol 26.3% e Pirinina Y 0.001%). Os lisados ​​foram fervidos durante 5 min antes do carregamento em géis de dodecilsulfato de sódio (SDS) poliacrilamida. As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e as membranas foram bloqueadas por 1 h em Leite a 5% / TBST. Os anticorpos primários foram diluídos em 5% de leite / TBST e incubados com o blot durante a noite a 4 C. Anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (HRP) foram diluídos em 5% de leite / TBST. Os blots foram processados ​​com quimioluminescência aprimorada e quantificações densitométricas foram realizadas usando o software ImageJ.

Sulforafano é um produto químico da coleção isotiocianato de substâncias organossulfúricas obtidas a partir de vegetais crucíferos, incluindo brócolis, repolho, couve-flor, couve e couve, entre outros. O sulforafano é produzido quando a enzima mirosinase transforma a glucorafanina, um glucosinolato, em sulforafano, também conhecido como sulforafano-glicosinolato. Brotos de couve-flor e couve-flor têm a maior concentração de glucorafanina ou o precursor do sulforafano. Estudos de pesquisa demonstraram que o sulforafano aumenta a capacidade antioxidante do corpo humano para prevenir vários problemas de saúde. Dr. Alex Jimenez DC, Insight CCST

Sulforafano e seus efeitos sobre câncer, mortalidade, envelhecimento, cérebro e comportamento, doenças cardíacas e muito mais

Os isotiocianatos são alguns dos compostos vegetais mais importantes que você pode obter em sua dieta. Neste vídeo eu faço o caso mais abrangente para eles que já foi feito. Curto período de atenção? Pule para o seu tópico favorito clicando em um dos pontos de tempo abaixo. Cronograma completo abaixo.

Seções principais:

• 00: 01: 14 - Câncer e mortalidade
• 00: 19: 04 - envelhecimento
• 00: 26: 30 - Cérebro e comportamento
• 00: 38: 06 - recapitulação final
• 00: 40: 27 - dose

Cronograma completo:

• 00: 00: 34 - Introdução do sulforafano, um dos principais focos do vídeo.
• 00: 01: 14 - Consumo de vegetais crucíferos e reduções na mortalidade por todas as causas.
• 00: 02: 12 - risco de câncer de próstata.
• 00: 02: 23 - risco de câncer de bexiga.
• 00: 02: 34 - Câncer de pulmão em risco de fumantes.
• 00: 02: 48 - risco de câncer de mama.
• 00: 03: 13 - Hipotético: e se você já tem câncer? (intervencionista)
• 00: 03: 35 - Mecanismo plausível que direciona os dados associativos de câncer e mortalidade.
• 00: 04: 38 - Sulforafano e câncer.
• 00: 05: 32 - Evidência animal mostrando forte efeito do extrato de brócolis no desenvolvimento do tumor de bexiga em ratos.
• 00: 06: 06 - Efeito da suplementação direta de sulforafano em pacientes com câncer de próstata.
• 00: 07: 09 - Bioacumulação de metabólitos de isotiocianato no tecido mamário atual.
• 00: 08: 32 - Inibição de células estaminais de cancro da mama.
• 00: 08: 53 - Lição de História: os brassicas foram estabelecidos como tendo propriedades de saúde mesmo na Roma antiga.
• 00: 09: 16 - A capacidade do Sulforaphane de aumentar a excreção de carcinógeno (benzeno, acroleína).
• 00: 09: 51 - NRF2 como um interruptor genético através de elementos de resposta antioxidante.
• 00: 10: 10 - Como a ativação de NRF2 aumenta a excreção de carcinógenos via conjugados de glutationa-S.
• 00: 10: 34 - As couves-de-bruxelas aumentam a glutationa-S-transferase e reduzem os danos no DNA.
• 00: 11: 20 - Bebida de brócolis aumenta a excreção de benzeno em 61%.
• 00: 13: 31 - O homogenato de brócolis aumenta as enzimas antioxidantes nas vias aéreas superiores.
• 00: 15: 45 - Consumo de vegetais crucíferos e mortalidade por doenças cardíacas.
• 00: 16: 55 - Brócolis em pó melhora os lipídios no sangue e o risco geral de doenças cardíacas em diabéticos tipo 2.
• 00: 19: 04 - Início da seção de envelhecimento.
• 00: 19: 21 - dieta enriquecida com sulforafano aumenta a vida útil de besouros de 15 a 30% (em certas condições).
• 00: 20: 34 - Importância da baixa inflamação para a longevidade.
• 00: 22: 05 - Os vegetais crucíferos e o pó de brócolis parecem reduzir uma grande variedade de marcadores inflamatórios em humanos.
• 00: 23: 40 - Recapitulação de vídeo intermediário: câncer, seções de envelhecimento
• 00: 24: 14 - Estudos com ratos sugerem que o sulforafano pode melhorar a função imunológica adaptativa na velhice.
• 00: 25: 18 - Sulforaphane melhorou o crescimento do cabelo em um modelo de rato de calvície. Imagem no 00: 26: 10.
• 00: 26: 30 - Início da seção do cérebro e comportamento.
• 00: 27: 18 - Efeito do extrato de brócolis no autismo.
• 00: 27: 48 - Efeito da glucorafanina na esquizofrenia.
• 00: 28: 17 - Início da discussão sobre depressão (mecanismo plausível e estudos).
• 00: 31: Estudo 21 - Mouse usando 10 diferentes modelos de depressão induzida por estresse mostram sulforafano igualmente eficaz como fluoxetina (prozac).
• 00: 32: 00 - Estudo mostra a ingestão direta de glucorafanina em camundongos é igualmente eficaz na prevenção da depressão do modelo de estresse de derrota social.
• 00: 33: 01 - Início da seção de neurodegeneração.
• 00: 33: 30 - Sulforafano e doença de Alzheimer.
• 00: 33: 44 - Sulforaphane e doença de Parkinson.
• 00: 33: 51 - Sulforaphane e doença de Hungtington.
• 00: 34: 13 - Sulforafano aumenta as proteínas de choque térmico.
• 00: 34: 43 - Início da seção de traumatismo cranioencefálico.
• 00: 35: 01 - Sulforafano injetado imediatamente após o TBI melhora a memória (estudo do mouse).
• 00: 35: 55 - Sulforafano e plasticidade neuronal.
• 00: 36: 32 - Sulforaphane melhora o aprendizado em modelos de diabetes tipo II em camundongos.
• 00: 37: 19 - Sulforafano e distrofia muscular de duchenne.
• 00: 37: 44 - Inibição da miostatina em células satélites musculares (in vitro).
• 00: 38: 06 - Recapitulação de vídeo tardio: mortalidade e câncer, danos no DNA, estresse oxidativo e inflamação, excreção de benzeno, doença cardiovascular, diabetes tipo II, efeitos no cérebro (depressão, autismo, esquizofrenia, neurodegeneração), via NRF2.
• 00: 40: 27 - Pensamentos em descobrir uma dose de brotos de brócolis ou sulforafano.
• 00: 41: 01 - Anedotas sobre brotar em casa.
• 00: 43: 14 - Nas temperaturas de cozimento e atividade de sulforafano.
• 00: 43: 45 - Conversão da bactéria intestinal do sulforafano da glucorafanina.
• 00: 44: 24 - Os suplementos funcionam melhor quando combinados com a mirosinase ativa de vegetais.
• 00: 44: 56 - Técnicas de cozinha e vegetais crucíferos.
• 00: 46: 06 - Isotiocianatos como sendo goitrogénios.

Agradecimentos

Sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231716302750

Como o sulforafano é produzido?

O aquecimento diminui a atividade da proteína epithiospecifier e aumenta a formação de sulforafano em brócolis

Sumário

O sulforafano, um isotiocianato de brócolis, é um dos anticarcinógenos derivados de alimentos mais potentes. Este composto não está presente no vegetal intacto, mas é formado a partir de seu precursor de glucosinolato, a glucorafanina, pela ação da mirosinase, uma enzima tioglucosidase, quando o tecido de brócolis é triturado ou mastigado. No entanto, vários estudos demonstraram que o rendimento do sulforafano a partir da glucorafanina é baixo e que um análogo do nitrila não bioativo, o sulforafano nitrila, é o produto primário da hidrólise quando o tecido vegetal é triturado em temperatura ambiente. Evidências recentes sugerem que em Arabidopsis, a formação de nitrila a partir de glucosinolatos é controlada por uma proteína sensível ao calor, a proteína epitiospecificadora (ESP), um cofator não catalítico da mirosinase. Nossos objetivos foram examinar os efeitos do aquecimento de floretes e brotos de brócolis na formação de nitrila sulforafano e sulforafano, para determinar se os brócolis contém atividade ESP, então correlacionar mudanças dependentes do calor na atividade ESP, conteúdo de sulforafano e bioatividade, conforme medido por indução enzima de desintoxicação de fase II quinona redutase (QR) em cultura de células. O aquecimento de floretes de brócolis frescos ou brotos de brócolis a 60 C antes da homogeneização aumentou simultaneamente a formação de sulforafano e diminuiu a formação de nitrila de sulforafano. Uma perda significativa de atividade de ESP foi paralela à diminuição na formação de nitrila de sulforafano. O aquecimento a 70 C e acima diminuiu a formação de ambos os produtos em floretes de brócolis, mas não em brotos de brócolis. A indução de QR em células Hepa lclc7 de hepatoma de camundongo em cultura aumentou paralelamente à formação de sulforafano.

O pré-aquecimento de floretes e brotos de brócolis a 60 C aumentou significativamente a formação catalisada por mirosinase de sulforafano (SF) em extratos de tecidos vegetais após a trituração. Isso foi associado a diminuições na formação de sulforafano nitrila (SF Nitrila) e na atividade da proteína epitiospecificadora (ESP).

Palavras-chave: Brócolis, Brassica oleracea, Crucíferas, Câncer, Anticarcinogênio, Sulforafano, Sulforafane nitrilo, Proteína epithiospecifier, Quinona redutase

Em conclusão, o sulforafano é um fitoquímico encontrado em brócolis e outros vegetais crucíferos. Uma quantidade descontrolada de oxidantes causada por fatores internos e externos pode causar estresse oxidativo no corpo humano, que pode levar a uma variedade de problemas de saúde. O sulforafano pode ativar a produção de Nrf2, um fator de transcrição que ajuda a regular os mecanismos antioxidantes de proteção que controlam a resposta da célula aos oxidantes. O escopo de nossas informações é limitado a questões de quiropraxia e saúde da coluna vertebral. Para discutir o assunto, sinta-se à vontade para perguntar ao Dr. Jimenez ou entre em contato conosco em 915-850-0900 .

Curated pelo Dr. Alex Jimenez

Referenciado de: Sciencedirect.com

Discussão de tópico adicional: Dor nas costas aguda

Dor nas costasEssa é uma das causas mais prevalentes de deficiência e dias perdidos no trabalho em todo o mundo. A dor nas costas é atribuída ao segundo motivo mais comum para as consultas médicas, superada apenas pelas infecções respiratórias superiores. Aproximadamente 80 por cento da população sentirá dor nas costas pelo menos uma vez ao longo da vida. A coluna vertebral é uma estrutura complexa composta de ossos, articulações, ligamentos e músculos, entre outros tecidos moles. Por causa disso, lesões e / ou condições agravadas, comohérnia de discos, pode eventualmente levar a sintomas de dor nas costas. Lesões esportivas ou acidentes automobilísticos geralmente são a causa mais frequente de dor nas costas, no entanto, às vezes, o mais simples dos movimentos pode ter resultados dolorosos. Felizmente, opções alternativas de tratamento, como quiropraxia, podem ajudar a aliviar a dor nas costas através do uso de ajustes espinhais e manipulações manuais, melhorando o alívio da dor.

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